Biacore T200
Opis
Biacore T200 je avtomatski refraktometer, ki omogoča hitro analizo velikega števila interakcij. Za meritve interakcij označevanje molekul ni potrebno. S sistemom lahko pridobimo kvalitetne podatke o kinetiki, afiniteti, koncentraciji, specifičnosti in termodinamiki interakcij. Meritve potekajo na senzorskem čipu s štirimi pretočnimi celicami, kar omogoča hkratno merjenje interakcij s tremi različnimi ligandi. Za analizo večjega števila analitov je za uporabo na voljo mikrotitrna ploščica s 384 jamicami. Razpon velikosti molekul, ki jih lahko analiziramo, je zelo velik (od ionov do virusov). Instrument vsebuje avtomatski odzračevalnik, zato predhodno odzračevnje pufrov ni potrebno. Možna je titracija znotraj enega cikla (ang. single-cycle titration) in določevanje koncentracije vzorca brez predhodne umeritvene krivulje. Možno je tudi zbiranje vezanih molekul za kasnejšo analizo z masno spektrometrijo. Omogoča tudi gretje (do 45 °C) in hlajenje (do 4 °C) vzorcev. Omogoča zbiranje vezanih molekul za kasnejšo analizo z masno spektrometrijo. Možna je nadgradnja za delo v GxP okolju.
Lastnosti
| Meritve | afiniteta (KD), kinetika (ka, kd), aktivna koncentracija, termodinamika |
| Nanos vzorca | avtomatski |
| Tip vzorca | majhne molekule, proteini, DNA, RNA, polisaharidi, lipidi, celice, virusi |
| Pretok | 1-100 μl/min |
| Tipične koncentracije (proteini) | pM-μM |
| Volumen vzorca | 2-350 μl |
| Območje lomnih količnikov | 1,33-1,40 |
| Temperaturno območje analize | 4-45 °C |
| Število merilnih celic | 4 |
| Sprotno odštevanje reference | da |
| Testiranje pri večih pufrih | da |
| Koncentracija vzorca | 10-3-10-11 M |
| Konstanta asociacije (ka) | 103 do 3 x 109 M-1s-1 za proteine, 103 do x 107 M-1s-1 za majhne molekule |
| Konstanta disociacije (kd) | 10-5-1 s-1 |
| Šum bazne linije | običajno < 0,03 RU |
| Drsenje bazne linije | < 0,3 RU/min |
| Merjenje koncentracije brez umeritvene krivulje | da |
| Meritve znotraj enega cikla | da |
Priprava vzorcev
| Potrebna čistost/kvaliteta vzorcev |
Analiti morajo biti zelo čisti in homogeni. Proteini na primer naj bodo testirani z NaDS-PAGE z najmanj 1 μg proteina, kjer naj protein potuje kot ena sama dobro vidna lisa (oz. npr. najmanj 95-odstotna čistost). Podobno je potrebno preveriti DNA na agaroznem gelu in homogenost lipidnih veziklov z DLS. |
| Količina, potrebna za tipično meritev |
Ligand (pritrjen na površino): ~ 10-50 µg proteina/~ 0.1-0.3 µg DNA/~ 100–300 µl 200 µM veziklov za eno imobilizacijo. Analit: ~ 200 µl molekule s koncentracijo okoli 10 x nad pričakovano KD (za eno titracijo). |
| Izbira pufra |
Najpogosteje uporabljeni pufri so HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA, 0,005% P-20), TBS-P (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,005% P-20) in PBS-P (10,1 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,005% P-20). V pufre pogosto dodajamo dodatke za zmanjševanje nespecifičnih interakcij: 0,1% BSA, 0,1–10 mg/ml CM-dekstrana (v primeru senzorskih čipov z dekstrani), povečanje koncentracije detergenta (do 0,1%), povečanje koncentracije soli (do 250 mM NaCl), 3 mM EDTA. Pri delu z lipidnimi vezikli pufri ne smejo vsebovati detergentov. Pri koraku aminskega spajanja (pri imobilizaciji liganda) se je potrebno izogniti pufrom, ki vsebujejo Tris. Kadar vzorci potrebujejo glicerol ali DMSO, je treba biti posebej pozoren na izenačitev pufrov med vzorci in kontrolami. |
| Ostalo |
Gostujoče raziskovalce prosimo, da pred merjenjem izpolnijo obrazec (Sample request form). Pufre in potrošni material za poskuse lahko po predhodnem dogovoru zagotovi Kemijski inštitut/Infrastrukturni center za raziskave molekulskih interakcij. |