Biacore T200
Opis
Biacore T200 je avtomatski refraktometer, ki omogoÄa hitro analizo velikega števila interakcij. Za meritve interakcij oznaÄevanje molekul ni potrebno. S sistemom lahko pridobimo kvalitetne podatke o kinetiki, afiniteti, koncentraciji, specifiÄnosti in termodinamiki interakcij. Meritve potekajo na senzorskem Äipu s štirimi pretoÄnimi celicami, kar omogoÄa hkratno merjenje interakcij s tremi razliÄnimi ligandi. Za analizo veÄjega števila analitov je za uporabo na voljo mikrotitrna plošÄica s 384 jamicami. Razpon velikosti molekul, ki jih lahko analiziramo, je zelo velik (od ionov do virusov). Instrument vsebuje avtomatski odzraÄevalnik, zato predhodno odzraÄevnje pufrov ni potrebno. Možna je titracija znotraj enega cikla (ang. single-cycle titration) in doloÄevanje koncentracije vzorca brez predhodne umeritvene krivulje. Možno je tudi zbiranje vezanih molekul za kasnejšo analizo z masno spektrometrijo. OmogoÄa tudi gretje (do 45 °C) in hlajenje (do 4 °C) vzorcev. OmogoÄa zbiranje vezanih molekul za kasnejšo analizo z masno spektrometrijo. Možna je nadgradnja za delo v GxP okolju.
Oprema je na voljo notranjim in zunanjim uporabnikom ob predhodem povpraševanju.
Zainteresirani uporabniki naj kontaktirajo skrbnico naprave.
Opremo lahko ob vnaprejšnjem dogovoru uporabljajo usposobljeni operaterji ali pa meritev izvede osebje Odseka za molekularno biologijo in nanobiotehnologijo.
Lastnosti
| Meritve | afiniteta (KD), kinetika (ka, kd), aktivna koncentracija, termodinamika |
| Nanos vzorca | avtomatski |
| Tip vzorca | majhne molekule, proteini, DNA, RNA, polisaharidi, lipidi, celice, virusi |
| Pretok | 1-100 μl/min |
| TipiÄne koncentracije (proteini) | pM-μM |
| Volumen vzorca | 2-350 μl |
| ObmoÄje lomnih koliÄnikov | 1,33-1,40 |
| Temperaturno obmoÄje analize | 4-45 °C |
| Število merilnih celic | 4 |
| Sprotno odštevanje reference | da |
| Testiranje pri veÄih pufrih | da |
| Koncentracija vzorca | 10-3-10-11 M |
| Konstanta asociacije (ka) | 103 do 3 x 109 M-1s-1 za proteine, 103 do x 107 M-1s-1 za majhne molekule |
| Konstanta disociacije (kd) | 10-5-1 s-1 |
| Šum bazne linije | obiÄajno < 0,03 RU |
| Drsenje bazne linije | < 0,3 RU/min |
| Merjenje koncentracije brez umeritvene krivulje | da |
| Meritve znotraj enega cikla | da |
Priprava vzorcev
| Potrebna Äistost/kvaliteta vzorcev |
Analiti morajo biti zelo Äisti in homogeni. Proteini na primer naj bodo testirani z NaDS-PAGE z najmanj 1 μg proteina, kjer naj protein potuje kot ena sama dobro vidna lisa (oz. npr. najmanj 95-odstotna Äistost). Podobno je potrebno preveriti DNA na agaroznem gelu in homogenost lipidnih veziklov z DLS. |
| KoliÄina, potrebna za tipiÄno meritev |
Ligand (pritrjen na površino): ~ 10-50 µg proteina/~ 0.1-0.3 µg DNA/~ 100–300 µl 200 µM veziklov za eno imobilizacijo. Analit: ~ 200 µl molekule s koncentracijo okoli 10 x nad priÄakovano KD (za eno titracijo). |
| Izbira pufra |
Najpogosteje uporabljeni pufri so HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA, 0,005% P-20), TBS-P (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,005% P-20) in PBS-P (10,1 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,005% P-20). V pufre pogosto dodajamo dodatke za zmanjševanje nespecifiÄnih interakcij: 0,1% BSA, 0,1–10 mg/ml CM-dekstrana (v primeru senzorskih Äipov z dekstrani), poveÄanje koncentracije detergenta (do 0,1%), poveÄanje koncentracije soli (do 250 mM NaCl), 3 mM EDTA. Pri delu z lipidnimi vezikli pufri ne smejo vsebovati detergentov. Pri koraku aminskega spajanja (pri imobilizaciji liganda) se je potrebno izogniti pufrom, ki vsebujejo Tris. Kadar vzorci potrebujejo glicerol ali DMSO, je treba biti posebej pozoren na izenaÄitev pufrov med vzorci in kontrolami. |
| Ostalo |
GostujoÄe raziskovalce prosimo, da pred merjenjem izpolnijo obrazec (Sample request form). Pufre in potrošni material za poskuse lahko po predhodnem dogovoru zagotovi Kemijski inštitut/Infrastrukturni center za raziskave molekulskih interakcij. |