Biacore T200

Opis

Biacore T200 je avtomatski refraktometer, ki omogoča hitro analizo velikega števila interakcij. Za meritve interakcij označevanje molekul ni potrebno. S sistemom lahko pridobimo kvalitetne podatke o kinetiki, afiniteti, koncentraciji, specifičnosti in termodinamiki interakcij. Meritve potekajo na senzorskem čipu s štirimi pretočnimi celicami, kar omogoča hkratno merjenje interakcij s tremi različnimi ligandi. Za analizo večjega števila analitov je za uporabo na voljo mikrotitrna ploščica s 384 jamicami. Razpon velikosti molekul, ki jih lahko analiziramo, je zelo velik (od ionov do virusov). Instrument vsebuje avtomatski odzračevalnik, zato predhodno odzračevnje pufrov ni potrebno. Možna je titracija znotraj enega cikla (ang. single-cycle titration) in določevanje koncentracije vzorca brez predhodne umeritvene krivulje. Možno je tudi zbiranje vezanih molekul za kasnejšo analizo z masno spektrometrijo. Omogoča tudi gretje (do 45 °C) in hlajenje (do 4 °C) vzorcev. Omogoča zbiranje vezanih molekul za kasnejšo analizo z masno spektrometrijo. Možna je nadgradnja za delo v GxP okolju. 

Lastnosti

Meritve afiniteta (KD), kinetika (ka, kd), aktivna koncentracija, termodinamika
Nanos vzorca avtomatski
Tip vzorca majhne molekule, proteini, DNA, RNA, polisaharidi, lipidi, celice, virusi
Pretok 1-100 μl/min
Tipične koncentracije (proteini) pM-μM
Volumen vzorca 2-350 μl
Območje lomnih količnikov 1,33-1,40
Temperaturno območje analize 4-45 °C
Število merilnih celic 4
Sprotno odštevanje reference da
Testiranje pri večih pufrih da
Koncentracija vzorca 10-3-10-11 M
Konstanta asociacije (ka) 103 do 3 x 109 M-1s-1 za proteine, 103 do x 107 M-1s-1 za majhne molekule
Konstanta disociacije (kd) 10-5-1 s-1
Šum bazne linije običajno < 0,03 RU
Drsenje bazne linije < 0,3 RU/min
Merjenje koncentracije brez umeritvene krivulje da
Meritve znotraj enega cikla da

Priprava vzorcev

Potrebna čistost/kvaliteta vzorcev

Analiti morajo biti zelo čisti in homogeni. Proteini na primer naj bodo testirani z NaDS-PAGE z najmanj 1 μg proteina, kjer naj protein potuje kot ena sama dobro vidna lisa (oz. npr. najmanj 95-odstotna čistost). Podobno je potrebno preveriti DNA na agaroznem gelu in homogenost lipidnih veziklov z DLS.
Koncentracijo analita je treba določiti čim natančneje (spektrofotometrično) in jo izmeriti tik pred poskusom.
Čistost liganda (molekula, pritrjena na senzorski čip) je lahko manjša.

Količina, potrebna za tipično meritev

Ligand (pritrjen na površino): ~ 10-50 µg proteina/~ 0.1-0.3 µg DNA/~ 100–300 µl 200 µM veziklov za eno imobilizacijo.

Analit: ~ 200 µl molekule s koncentracijo okoli 10 x nad pričakovano KD (za eno titracijo).

Izbira pufra

Najpogosteje uporabljeni pufri so HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA, 0,005% P-20), TBS-P (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,005% P-20) in PBS-P (10,1 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,005% P-20).

V pufre pogosto dodajamo dodatke za zmanjševanje nespecifičnih interakcij: 0,1% BSA, 0,1–10 mg/ml CM-dekstrana (v primeru senzorskih čipov z dekstrani), povečanje koncentracije detergenta (do 0,1%), povečanje koncentracije soli (do 250 mM NaCl), 3 mM EDTA.

Pri delu z lipidnimi vezikli pufri ne smejo vsebovati detergentov. Pri koraku aminskega spajanja (pri imobilizaciji liganda) se je potrebno izogniti pufrom, ki vsebujejo Tris.

Kadar vzorci potrebujejo glicerol ali DMSO, je treba biti posebej pozoren na izenačitev pufrov med vzorci in kontrolami.

Ostalo

Gostujoče raziskovalce prosimo, da pred merjenjem izpolnijo obrazec (Sample request form).

Pufre in potrošni material za poskuse lahko po predhodnem dogovoru zagotovi Kemijski inštitut/Infrastrukturni center za raziskave molekulskih interakcij.

Kontakt

Gregor Bajc

gregor.bajc@bf.uni-lj.si

Biotehniška fakulteta

Večna pot 111, 1000 Ljubljana

Dokumenti

  • Lastnosti
  • Biacore T100 Instrument Handbook
  • Biacore T100 Software Handbook