Biacore X100

Opis

Biacore X100 (GE Healthcare) je avtomatski refraktometer za analizo molekulskih interakcij s površinsko plazmonsko resonanco. V enem samem eksperimentu se lahko analizira vezavo do 15 različnih molekul. Instrument vsebuje avtomatski ozdračevalnik, zato predhodno odzračevnje pufrov ni potrebno. Možna je titracija znotraj enega cikla (ang. single-cycle titration) in določevanje koncentracije vzorca brez predhodne umeritvene krivulje.

Lastnosti

Meritve afiniteta (KD), kinetika (ka, kd), aktivna koncentracija, termodinamika
Nanos vzorca avtomatski
Detekcija molekul > 100 Da
Pretok 1–100 μl/min
Tipične koncentracije (proteini) pM–μM
Volumen vzorca 50–120 μl
Območje lomnih količnikov 1,33–1,40
Temperaturno območje analize 25° C
Število merilnih celic 2
Sprotno odštevanje reference da
Testiranje pri večih pufrih ne
Koncentracija vzorca 10-11–10-3 M
Konstanta asociacije (ka) 103–107 M-1 s-1
Konstanta disociacije (kd) 10-5-0,5 s-1
Šum bazne linije < 0,1 RU
Drsenje bazne linije < 0,3 RU/min
Določanje koncentracije brez umeritvene krivulje da
Meritve znotraj enega cikla da

Priprava vzorcev

Potrebna čistost/kvaliteta vzorcev

Analiti morajo biti zelo čisti in homogeni. Proteini na primer naj bodo testirani z NaDS-PAGE z najmanj 1 μg proteina, kjer naj protein potuje kot ena sama dobro vidna lisa (oz. npr. najmanj 95-odstotna čistost). Podobno je potrebno preveriti DNA na agaroznem gelu in homogenost lipidnih veziklov z DLS.
Koncentracijo analita je treba določiti čim natančneje (spektrofotometrično) in jo izmeriti tik pred poskusom.
Čistost liganda (molekula, pritrjena na senzorski čip) je lahko manjša.

Količina, potrebna za tipično meritev

Ligand (pritrjen na površino): ~ 10-50 µg proteina/~ 0.1-0.3 µg DNA/~ 100–300 µl 200 µM veziklov za eno imobilizacijo.

Analit: ~ 200 µl molekule s koncentracijo okoli 10 x nad pričakovano KD (za eno titracijo).

Izbira pufra

Najpogosteje uporabljeni pufri so HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA, 0,005% P-20), TBS-P (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,005% P-20) in PBS-P (10,1 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,005% P-20).

V pufre pogosto dodajamo dodatke za zmanjševanje nespecifičnih interakcij: 0,1% BSA, 0,1–10 mg/ml CM-dekstrana (v primeru senzorskih čipov z dekstrani), povečanje koncentracije detergenta (do 0,1%), povečanje koncentracije soli (do 250 mM NaCl), 3 mM EDTA.

Pri delu z lipidnimi vezikli pufri ne smejo vsebovati detergentov. Pri koraku aminskega spajanja (pri imobilizaciji liganda) se je potrebno izogniti pufrom, ki vsebujejo Tris.

Kadar vzorci potrebujejo glicerol ali DMSO, je treba biti posebej pozoren na izenačitev pufrov med vzorci in kontrolami.

Ostalo

Gostujoče raziskovalce prosimo, da pred merjenjem izpolnijo obrazec (Sample request form).

Pufre in potrošni material za poskuse lahko po predhodnem dogovoru zagotovi Kemijski inštitut.

Kontakt

Neža Omersa

neza.omersa@ki.si

Kemijski inštitut

Hajdrihova 19, 1000 Ljubljana

Dokumenti

  • Biacore X100 Getting started
  • Biacore X100 Handbook
  • Biacore X100 The personal Biacore experience